什么是TA克隆技術(shù)

 TA克隆技術(shù)（TA cloning）利用Taq聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）活性，但卻不具有3'-5'端外切酶校準(zhǔn)活性的特點(diǎn)，可在PCR產(chǎn)物的3'端加上一個(gè)非模板依賴(lài)堿基“A”。pMD18-T是一種克隆PCR產(chǎn)物的載體，它是由pUC18載體在Xba I和Sal I識(shí)別位點(diǎn)間插入一個(gè)EcoR V位點(diǎn)，然后用EcoR V進(jìn)行酶切使質(zhì)粒線(xiàn)性化，并在它的3'端添加“T”構(gòu)建而成。因其3'端帶有一個(gè)突出的“T”尾，能地與帶“A”尾的PCR產(chǎn)物連接，極大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR產(chǎn)物zui簡(jiǎn)便、快捷的方法。
　　TA 克隆的idea zui初來(lái)自1994 年。幾位學(xué)者發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶會(huì)在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)脫氧腺苷（A），而且這種特性與模板無(wú)關(guān)。之后，Invitrogen 公司發(fā)明了TA 克隆技術(shù)，并擁有TA cloning 商標(biāo)的權(quán)，直至2013 年。線(xiàn)性化的T 載體在3’末端擁有一個(gè)脫氧胸苷（T），與PCR 產(chǎn)物的A 尾巴互補(bǔ)。原理就是這么簡(jiǎn)單。不過(guò)由于價(jià)格的原因，Invitrogen 的T 載體在國(guó)內(nèi)卻不是銷(xiāo)量的。Promega 的pGEM-T（easy）和Takara 的pMD18-T 因性?xún)r(jià)比高，更加深入人心。
　　TA 克隆的步驟無(wú)需贅述，相信大家都很清楚。無(wú)非就是PCR、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定這幾個(gè)步驟，不過(guò)還有一些不得不說(shuō)的問(wèn)題，值得大家注意。
　　1、用什么樣的聚合酶？
　　不是所有的聚合酶都會(huì)在PCR產(chǎn)物末端加A。具有3’到5’外切酶活性的高保真酶就不會(huì)產(chǎn)生A 尾巴。如果你下一步想要做基因表達(dá)，一定要用高保真酶，那也沒(méi)問(wèn)題。只要用Taq 酶在產(chǎn)物末端加個(gè)A 就OK。步驟也很簡(jiǎn)單，根本無(wú)需買(mǎi)個(gè)什么加 A 試劑盒，幾步就搞定了。
　　1. 用高保真酶擴(kuò)增完之后，在反應(yīng)管中加入 0.7-1 unit 的Taq 聚合酶。無(wú)需更換buffer，其中的dATP 已經(jīng)夠用。
　　2. 在72℃孵育8-10 分鐘。
　　3. 立即進(jìn)行純化，沉淀、跑膠、或用純化試劑盒。這一點(diǎn)相當(dāng)重要，否則高保真聚合酶會(huì)將A 尾巴或T 載體上的T 尾巴切掉。
　　有些率的聚合酶其實(shí)是Taq 酶和高保真酶的混合物，大約有一半的產(chǎn)物加了A 尾巴。所以你在克隆之前搞清楚你用的酶到底是否加 A，否則克隆出來(lái)白斑太少，又要討論好久。
　　2、PCR 產(chǎn)物的純度
　　如果你的PCR 產(chǎn)物只有*條帶，恭喜你。不過(guò)為保險(xiǎn)起見(jiàn)，還是用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒來(lái)純化一次。否則白色菌落中的插入片段可能是引物二聚體哦。如果你發(fā)現(xiàn)有非特異條帶，那優(yōu)化一下PCR 反應(yīng)，讓非特異條帶消失。跑膠純化是下策，因?yàn)槟z純化可能會(huì)帶走3’的A 尾巴。而且注意不要在紫外燈下暴露太久。只需5 秒，紫外對(duì)DNA 的傷害就足以檢測(cè)；而長(zhǎng)達(dá)60 秒的照射會(huì)讓某段序列在測(cè)序時(shí)無(wú)法讀取。問(wèn)題遠(yuǎn)比你想象中嚴(yán)重。
　　易生物提示：PCR 產(chǎn)物其實(shí)也有保質(zhì)期。為了保證連接效率，PCR 產(chǎn)物不要超過(guò)一天。因?yàn)樯厦娴腁 尾巴會(huì)隨著時(shí)間逐漸降解，導(dǎo)致連接效率下降。千萬(wàn)不要為了省事，就整個(gè)一大管 PCR 產(chǎn)物，每次用一點(diǎn)。zui終反而更浪費(fèi)時(shí)間。
　　3、載體和片段的比例
　　這往往是影響克隆效果的zui大因素。通常來(lái)說(shuō)，載體與片段的起始摩爾比為1：1。計(jì)算方法如下：
　　X ng PCR 產(chǎn)物 = （ng 載體 × kb 片段大小） / kb 載體大小
　　如果這樣的比例不能令你滿(mǎn)意，你可以在3： 1 到1：3 的范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化，選擇*的比例。 PCR 產(chǎn)物的濃度可以通過(guò)與Marker 比對(duì)估算出來(lái)。還有一種更準(zhǔn)確的方法，用GE 的NanoVue 超微量分光光度計(jì)。只需要0.5 ul，就能測(cè)量出樣品濃度，你再也不用舍不得珍貴的樣品了。0.5 ul 而已，小意思。